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小鼠雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體（mAb）具有耗時(shí)長、局限于特定動(dòng)物物種的缺點(diǎn)，另外，B細(xì)胞和骨髓瘤伴侶的融合效率低限制了單克隆抗體的復(fù)現(xiàn)機(jī)會(huì)。而噬菌體、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)中，親本文庫是通過重鏈和輕鏈基因的隨機(jī)組合構(gòu)建的，免疫反應(yīng)中一些體內(nèi)重鏈和輕鏈庫會(huì)丟失，非自然可變區(qū)對無法有效結(jié)合，導(dǎo)致可用的抗體很少。這些技術(shù)方案的瓶頸，制約了抗體篩選研究的發(fā)展。
單B細(xì)胞+CFPS高通量篩選方案
單B細(xì)胞篩選技術(shù)可以利用免疫動(dòng)物的單個(gè)B細(xì)胞快速生成mAb，是獲得天然抗體庫的有力技術(shù)。其中，mAb的重組生產(chǎn)通常是用動(dòng)物細(xì)胞（如CHO和HEK 293）瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的，而動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)至少需要3~5天，這極大限制限制了抗體篩選速度。
無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）為mAb表達(dá)提供了一種新方式。該技術(shù)通過將細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等合成蛋白所需要的分子機(jī)器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒有活細(xì)胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)。
CFPS在高通量重組蛋白表達(dá)方面相比體內(nèi)表達(dá)方法具有顯著優(yōu)勢：
1
CFPS無需基因克隆、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞裂解，流程簡單、表達(dá)快速；
2
CFPS允許高通量表達(dá)，且便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可適配高通量移液工作站進(jìn)行高通量、自動(dòng)化抗體表達(dá)，更節(jié)省人力成本；
3
CFPS開放性、可控性強(qiáng)，允許添加輔助蛋白折疊的酶，促進(jìn)抗體上清可溶表達(dá)。
圖1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)篩選與CFPS高通量篩選流程示意圖
單B細(xì)胞+CFPS高通量篩選案例
目前，已有報(bào)道通過單B細(xì)胞建立抗體庫以及CFPS表達(dá)mAb的篩選方案，在2天內(nèi)完成了抗原特異性mAb的篩選。該方案包括從免疫兔的外周血中收集B細(xì)胞、通過抗原包被的磁珠和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)染色選擇B細(xì)胞、基于單細(xì)胞的PCR、在CFPS中生產(chǎn)mAb以及CFPS產(chǎn)物直接進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。
圖2 利用CFPS從單B細(xì)胞中快速篩選單克隆抗體的Ecobody技術(shù)
（一）B細(xì)胞篩選與分離
研究人員從用滅活副溶血性弧菌免疫的兔子的幾毫升血液中采集6.8×106個(gè)淋巴細(xì)胞，用ER追蹤器對細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）收集到約2.0×104個(gè)細(xì)胞顯示強(qiáng)熒光的細(xì)胞。隨后，將涂有滅活副溶血性弧菌的磁珠加入細(xì)胞混合物中，用磁鐵分離與抗原結(jié)合的約500個(gè)細(xì)胞，其中19個(gè)用于單細(xì)胞PCR。每10µL分離一個(gè)細(xì)胞到384孔板中，并在倒置相差顯微鏡下選擇和確認(rèn)細(xì)胞-磁珠復(fù)合物。
（二）單細(xì)胞RT-PCR
使用基因特異性引物和SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。第一次 PCR使用與信號(hào)肽(SP)序列和抗體基因恒定區(qū)退火的引物，第二次 PCR使用帶有后續(xù)Gibson組裝步驟所需尾巴的引物。
以上環(huán)節(jié)在第一天完成。
（三）構(gòu)建CFPS模板與CFPS反應(yīng)
通過Gibson組裝將T7啟動(dòng)子和終止子與抗體基因結(jié)合，然后通過PCR擴(kuò)增DNA片段，用于無細(xì)胞蛋白合成。
為了增強(qiáng)Hc和Lc的正確配對，研究人員還開發(fā)了一種名為“Zipbody"的改良Fab形式。即設(shè)計(jì)亮氨酸拉鏈(LZ) LZA和LZB，分別融合在Hc和Lc的C端。此外，還在N端添加短肽序列標(biāo)簽Ser-Lys-Ile-Lys(SKIK)，以提高蛋白表達(dá)水平。
隨后，使用DsbC和氧化谷胱甘肽（GSSG）通過CFPS表達(dá)帶有SKIK標(biāo)簽的Zipbody。
（四）ELISA實(shí)驗(yàn)
首先通過SDS-PAGE的熒光成像確認(rèn)了這些基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。然后，CFPS產(chǎn)物直接進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。所有以 Zipbody形式表達(dá)并包含 SKIK 標(biāo)簽的克隆對副溶血性弧菌的結(jié)合活性均高于對其他測試抗原（大腸桿菌 O157、O26、O111或BSA）的結(jié)合活性（圖 3a）。
圖3 Ecobody技術(shù)獲得的mAb的ELISA評估
（五）案例總結(jié)
該方法不需要將DNA轉(zhuǎn)染到活細(xì)胞中，也不需要細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)，只需將大腸桿菌細(xì)胞提取物與模板DNA（PCR片段）、氨基酸、核苷酸、T7 RNA聚合酶和能量源混合，即可在60至90分鐘內(nèi)獲得mAb，整個(gè)篩選過程比使用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的方法顯著簡化。此外，通過比較純化蛋白的WB和ELISA信號(hào)的條帶強(qiáng)度，該實(shí)驗(yàn)10 μL CFPS體系中mAb平均產(chǎn)量約為0.3 μg，即30 μg/mL。CFPS中mAb的表達(dá)量足夠通過ELISA進(jìn)行篩選，從而使過去可能因表達(dá)量不足被認(rèn)為活性低而被忽略的陽性克隆可以得到合理的評估。
珀羅汀生物CFPS抗體表達(dá)
珀羅汀生物自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)（CFPS）系統(tǒng)支持多條肽鏈的自主組裝，可實(shí)現(xiàn)VHH、scFv等抗體分子以及全長抗體IgG的上清可溶表達(dá)。已有ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，珀羅汀生物CFPS系統(tǒng)表達(dá)的抗體具備高免疫活性。
珀羅汀生物CFPS抗體表達(dá)案例一
圖4 某IgG與Fab片段SDS-PAGE圖及其ELISA活性（CFPS）
珀羅汀生物CFPS抗體表達(dá)案例二
圖5 某兩個(gè)VHH（左）與scFv（右）的SDS-PAGE圖（CFPS）
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